PCR

单细胞测序的相关知识，我觉得面试可能会问到的

一、PCR原理

1. 基本原理
   PCR是一种基于DNA半保留复制的体外扩增技术，通过反复的高温变性、低温退火和中温延伸三步循环，实现目标DNA片段的指数级扩增。
   • 变性：高温（通常95℃）使双链DNA解链为单链模板。
     
   • 退火：降温（通常55-65℃）使引物与互补序列结合。
     
   • 延伸：中温（通常72℃）下，Taq DNA聚合酶以dNTP为原料合成新链。
2. 关键要素
   • 引物：与目标DNA两端互补的短单链DNA片段，决定扩增特异性。
     
   • 耐热DNA聚合酶（如Taq酶）：耐高温，可在变性步骤后直接进行延伸。
     
   • dNTP：脱氧核苷三磷酸，作为合成新链的原料。
     
   • 缓冲液：提供适宜的pH和离子环境（如Mg²+）。
3. 指数扩增特性
   每个循环使目标DNA数量翻倍，30-35次循环后可扩增约10⁹倍。

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二、PCR方法步骤

1. 反应体系配置
   • 模板DNA：0.1-2 μg，需高纯度且不含抑制剂。
     
   • 引物：浓度5-20 μmol/L，需避免错配和二级结构。
     
   • dNTP：终浓度100-250 μmol/L，四者浓度需均衡。
     
   • Taq酶：5-10 U/反应，浓度过高易导致非特异性扩增。
     
   • 缓冲液：包含HEPES/MOPS缓冲体系、K⁺/NH₄⁺、Mg²+（1-3 mmol/L）及辅助成分（如DMSO）。
2. 热循环程序
   • 预变性：95℃ 2-5分钟（激活Taq酶，完全变性模板）。
     
   • 循环步骤（通常25-35次）：
     • 变性：95℃ 30秒（单链模板形成）。
       
     • 退火：55-65℃ 30秒（引物结合模板）。
       
     • 延伸：72℃ 1分钟/kb（合成新链）。
       
   • 最后延伸：72℃ 7-10分钟（确保引物完全延伸）。
     
   • 保存：4℃或冷却至16℃。
3. 扩增产物检测
   • 普通PCR：琼脂糖凝胶电泳（1.5-2%），溴化乙锭染色后紫外观察。
     
   • 实时荧光定量PCR（qPCR）：通过荧光信号（如SYBR Green或探针）实时监测扩增，计算Ct值（阈值循环数）。

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三、PCR注意事项

1. 实验设计与操作规范
   • 引物设计：
     • 长度18-25 bp，GC含量40-60%，避免连续5个以上相同碱基。
       
     • 退火温度（Tm值）需匹配，退火温度通常比Tm低3-5℃。
       
   • 模板处理：
     • 避免蛋白、酚、乙醇等抑制剂污染，浓度不宜过高。
       
   • 试剂管理：
     • dNTP、引物等分装保存，避免反复冻融；Taq酶最后加入。
2. 污染防控
   • 实验分区：严格划分试剂准备区、样本处理区、扩增区和产物分析区，防止气溶胶污染。
     
   • 耗材处理：使用无菌、无酶的耗材（如PCR管、枪头），避免交叉污染。
     
   • 操作规范：戴手套、勤更换；吸样时缓慢匀速，避免液体溅出或气溶胶形成。
3. 实验验证与优化
   • 对照设置：
     • 阳性对照（验证体系有效性）、阴性对照（排除污染）、空白对照（仅含反应体系）。
       
   • 参数调整：
     • 退火温度可通过梯度PCR优化；循环次数过多可能导致非特异性扩增。
       
   • 结果验证：
     • 电泳检测需在48小时内完成，避免条带消失；qPCR需校准标准曲线。
4. 常见问题及解决
   • 假阴性：模板降解、引物设计不当、Taq酶失活。
     
   • 非特异性扩增：退火温度过低、引物错配、Mg²+浓度过高。
     
   • 假阳性：污染（如试剂、气溶胶）、引物二聚体形成。
5. 设备与仪器要求
   • PCR仪：具备精确控温功能（均一性≤±0.2℃）。
     
   • qPCR仪：支持多通道荧光检测（如FAM、HEX），可实时监测扩增过程。