Western Blot

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Published

August 28, 2025

Western Blot（蛋白质免疫印迹）

原理

Western Blot是一种基于抗原-抗体特异性结合的分子生物学技术，用于检测特定蛋白质的存在、相对丰度及分子量。其核心原理包括以下三部分：

  1. SDS-PAGE电泳分离

    • SDS（十二烷基硫酸钠）：破坏蛋白质的非共价键，使蛋白质变性为线性结构，并均匀包裹负电荷（电荷与质量比相同）。
    • PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）：利用凝胶的孔径筛作用，根据蛋白质分子量大小进行分离（小分子迁移快，大分子迁移慢）。

  2. 蛋白质转移至固相膜

    • 通过电转移（湿转或半干转）将凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜或NC膜上，固定蛋白质以供后续检测。

  3. 抗体识别与显色/发光

    • 一抗：特异性识别目标蛋白。
    • 二抗：标记有HRP（辣根过氧化物酶）或荧光素，与一抗结合后通过化学发光、显色或荧光成像显示目标蛋白位置。

二、实验步骤

1. 样本制备

  • 细胞/组织裂解
    • 裂解液选择：
      • 普通细胞：RIPA裂解液（含1% PMSF）。
      • 难溶蛋白：加入1% SDS或NP-40。
      • 磷酸化蛋白：需添加磷酸酶抑制剂（如Na₃VO₄、NaF）。
    • 裂解条件：
      • 动物组织：30分钟内处理，切块冻存（-80℃）。
      • 植物样本：液氮研磨，保留健康组织。
      • 裂解后离心（4℃，12000-15000 rpm，10-15 min）取上清。
  • 蛋白定量
    • BCA法：标准品复孔，样品稀释5-10倍，37℃孵育30 min，562 nm读数（R²>0.99）。
    • Bradford法：适用于可溶蛋白，但可能受不可溶蛋白干扰。
  • 变性处理
    • 加入5×loading buffer（比例1:4），100℃煮沸10-20 min，使蛋白完全变性。

2. SDS-PAGE电泳

  • 凝胶制备
    • 分离胶浓度选择：
      • 小分子量蛋白（<30 kDa）：12-15%胶。
      • 中等分子量（30-70 kDa）：8-12%胶。
      • 大分子量（>70 kDa）：6-8%胶。
    • 灌胶步骤：
      • 分离胶灌注后加水封胶，凝固后吸去水层。
      • 浓缩胶（5%）灌注并插入梳子，凝固后拔除梳子形成上样孔。
  • 电泳条件
    • 浓缩胶：80 V，30-40 min（使样品压缩成线）。
    • 分离胶：120 V，1-1.5 h（根据蛋白大小调整时间）。
    • 注意事项：电泳缓冲液需预冷，避免高温导致“微笑条带”。

3. 蛋白质转膜

  • 膜选择
    • PVDF膜：机械强度高，适合多次剥脱，需甲醇活化。
    • NC膜：信噪比高，无需甲醇预处理，但不适合含SDS的转膜缓冲液。
  • 转膜步骤
    • 转膜缓冲液：含甲醇（20%），预冷至4℃。
    • 转膜装置：组装“三明治”（-海绵→滤纸→凝胶→膜→滤纸→海绵+），确保无气泡。
    • 转膜参数：
      • 30 kDa以下：30 min，220 mA。
      • 30-70 kDa：60-90 min，220 mA。
      • 70-150 kDa：90-180 min，220 mA。
    • 验证转膜：丽春红染色或考马斯亮蓝染色观察蛋白转移效果。

4. 封闭与抗体孵育

  • 封闭
    • 5%脱脂牛奶/TBST：室温1 h，阻断非特异性结合位点。
    • 快速封闭液：可缩短封闭时间（如10 min）。
  • 一抗孵育
    • 稀释比例：根据抗体说明书（如1:1000）。
    • 孵育条件：室温1 h或4℃过夜（需覆盖膜防止干燥）。
  • 二抗孵育
    • HRP标记二抗：稀释比例1:5000，室温1 h避光孵育。
    • 荧光标记二抗：适用于多色检测，需配合成像系统。
  • 洗涤
    • TBST/PBST：室温摇洗3次，每次10 min，去除未结合抗体。

5. 显色与成像

  • 化学发光法（ECL）
    • 显色时间：常规底物1 min，高性能底物（如SuperSignal）5 min。
    • 成像：使用X光胶片或化学发光成像仪（推荐后者，灵敏度更高）。
  • 显色法（DAB）
    • 适用于低丰度蛋白，但可能产生背景干扰。
  • 荧光法
    • 多色检测时需使用兼容的荧光成像系统。

三、关键注意事项

  1. 样本处理
    • 新鲜样本优先：动物组织30分钟内处理，植物样本去除枯黄部分。
    • 冻存规范：分装≤1 g，加入RNAlater防降解，标记清晰。
  2. 裂解液与抑制剂
    • 现用现加抑制剂：蛋白酶/磷酸酶抑制剂需在使用前加入裂解液。
    • 裂解时间控制：细胞裂解30 min，组织匀浆2 h（4℃）。
  3. 电泳与转膜优化
    • 凝胶选择：根据蛋白分子量选择梯度胶或均一胶。
    • 转膜效率：避免高电压导致膜破损，必要时使用预染Marker监控转膜。
  4. 抗体使用
    • 稀释比例：根据抗体说明书调整，避免过高浓度过高背景。
    • 对照设置：阳性/阴性对照（如内参蛋白GAPDH、β-Actin）确保特异性。
  5. 背景控制
    • 封闭充分：避免非特异性结合。
    • 内源IgG干扰：使用TidyBlot试剂（仅结合完整IgG）减少背景。
  6. 定量与重复
    • BCA/Braford：确保上样量一致（20-40 μg总蛋白）。
    • 重复实验：至少3次独立实验验证结果可靠性。
  7. 设备与耗材
    • 低温操作：离心机、电泳槽提前预冷，防止蛋白降解。
    • 膜保存：未使用的膜密封于-20℃，避免潮解。

四、常见问题与解决方案

问题 可能原因 解决方案
条带模糊或无信号 蛋白变性不完全、转膜失败 延长煮样时间，优化转膜参数
高背景信号 封闭不充分、抗体浓度过高 增加封闭时间，降低抗体稀释比例
条带位置异常 蛋白修饰（如磷酸化）、凝胶孔径不适 使用非还原条件，调整凝胶浓度
转膜不均 凝胶与膜之间有气泡 重新组装转膜装置，排除气泡
内参蛋白信号弱 上样量不足、内参抗体失效 增加上样量，验证内参抗体有效性

五、总结

Western Blot是蛋白分析的“金标准”，其成功依赖于严谨的样本处理、精确的电泳与转膜条件以及特异性抗体的合理使用。通过优化每一步骤（如裂解液配制、定量方法、抗体稀释），可显著提高实验重复性和数据可靠性。对于复杂样本（如组织裂解物），需特别注意内源干扰和背景控制。掌握这些细节，才能高效完成高质量的Western Blot实验。

Western Blot样本制备的原理与方法步骤

一、原理

Western Blot样本制备的核心目标是高效释放细胞或组织中的蛋白质，同时保持其完整性和活性，以便后续的电泳分离和检测。具体原理包括：

  1. 裂解细胞/组织
    • 通过裂解液破坏细胞膜和细胞器，释放蛋白质。裂解液通常含去垢剂（如SDS、Triton X-100）和盐类，以溶解膜结构。
  2. 抑制蛋白降解
    • 添加蛋白酶抑制剂（如PMSF、EDTA）和磷酸酶抑制剂（如Na₃VO₄），防止蛋白酶或磷酸酶在裂解过程中降解目标蛋白或修饰其活性。
  3. 定量与变性处理
    • 通过蛋白定量（如BCA法）确定样品浓度，确保上样量一致；加入SDS-PAGE上样缓冲液使蛋白质变性，便于电泳分离。

二、方法步骤

1. 细胞裂解

（1）悬浮细胞

  • 步骤：
    1. 离心收集细胞（1000-1500 rpm，5 min）。
    2. 用PBS洗涤1-2次，去除培养液中的血清和杂质。
    3. 加入裂解液（如RIPA裂解液，含蛋白酶/磷酸酶抑制剂），冰上裂解30 min。
    4. 若裂解不充分，可冰浴超声辅助裂解。
    5. 离心（4℃，12000-15000 rpm，10-15 min），取上清液用于后续实验。

（2）贴壁细胞

  • 步骤：
    1. 吸净培养液，用PBS洗涤1-2次。
    2. 加入裂解液直接裂解（或胰酶消化后按悬浮细胞处理，但需注意胰酶可能降解某些蛋白）。
    3. 冰上裂解30 min，离心后取上清。

（3）裂解液选择

  • 常规裂解液：RIPA（含1% Triton X-100、0.1% SDS）。
  • 难溶蛋白：添加1% SDS或NP-40。
  • 磷酸化蛋白：需额外添加磷酸酶抑制剂（如Na₃VO₄、NaF）。

2. 组织裂解

（1）预处理

  • 去除非目标成分：洗净血液、脂肪等（尤其对脾脏、心脏等富含IgG的组织）。
  • 灌流处理：实验动物可通过心脏灌注生理盐水（含PMSF），使组织颜色变白后再采集。

（2）破碎方法

  • 匀浆法：
    1. 按比例加入裂解液（如1:5组织重量:裂解液体积）。
    2. 使用玻璃匀浆器或电动匀浆器匀浆至无明显组织块。
  • 研磨法：
    1. 液氮冷冻组织后，在研钵中研磨成粉末。
    2. 加入裂解液裂解，混合均匀。

（3）离心与上清收集

  • 4℃离心（12000-15000 rpm，10-15 min），取上清液。

3. 蛋白定量

（1）BCA法

  • 原理：蛋白质在碱性条件下将Cu²⁺还原为Cu⁺，与BCA试剂反应生成紫色复合物，562 nm比色。
  • 步骤：
    1. 制作标准曲线（BSA梯度稀释）。
    2. 样品稀释5-10倍，与BCA工作液混合，37℃孵育30 min。
    3. 测定吸光度（R²>0.99时可靠）。

（2）Bradford法

  • 原理：考马斯亮蓝G-250染料与蛋白质结合后发生颜色变化（465-595 nm）。
  • 优点：快速、灵敏，适合可溶蛋白；但易受不可溶蛋白干扰。

4. 变性处理

  • 目的：使蛋白质完全变性，消除空间结构对电泳的影响。

  • 步骤：

    1. 加入5×SDS-PAGE上样缓冲液（1:4体积比）。
    2. 100℃煮沸10-20 min，或55℃加热30 min（避免高温降解敏感蛋白）。
    3. 冰浴冷却后进行电泳。

三、关键注意事项

  1. 防止蛋白降解
    • 全程低温操作（冰上裂解、4℃离心）。
    • 裂解液中必须现加蛋白酶/磷酸酶抑制剂。
  2. 分装与保存
    • 裂解液和样品避免反复冻融，分装后-80℃保存。
  3. 组织处理技巧
    • 富含IgG的组织（如脾脏）需充分洗涤，避免内源抗体干扰。
    • 液氮研磨适用于难裂解组织，但需注意研磨均匀性。
  4. 裂解效率优化
    • 难裂解细胞可尝试超声破碎或增加裂解液浓度。
    • 胰酶消化可能导致蛋白片段化，需根据实验需求权衡。

四、常见问题与解决方案

问题 可能原因 解决方案
蛋白浓度偏低 裂解不充分、组织未破碎完全 增加裂解时间，改用液氮研磨
高背景信号 内源IgG干扰（如脾脏组织） 充分洗涤组织，使用低IgG裂解液
蛋白降解 蛋白酶抑制剂失效或操作过热 现加抑制剂，全程低温操作
上样量不一致 定量误差 重复BCA/Bradford测定，取平均值